Knippen en plakken met patiënten-dna kan straks veel efficiënter

In 2020 was het concept een Nobelprijs waard: crispr-cas9, de handige knip- en plaktechniek voor dna-aanpassing. Hiermee kunnen onderzoekers met grote precisie genen uitschakelen, corrigeren of juist nieuwe genen invoegen. Wereldwijd barstten de ambities los: we zouden dna als Lego-masters naar onze hand kunnen zetten.

Deels gebeurt dat nu inderdaad: al tien jaar gebruiken wetenschappers crispr-cas9 in hun labs, bijvoorbeeld om de functie van genen te achterhalen. Maar genetische aandoeningen herstellen bij patiënten, de ultieme belofte, gebeurt alleen nog in klinische trials. Gene editing bij embryo’s is al helemáál toekomstmuziek.

Hoe komt dat? Waarom loopt de kliniek zo achter bij die hooggespannen verwachtingen? En bovenal: wat is daaraan te doen? Onderzoekers van het Leids Universitair Medisch Centrum (LUMC) publiceerden hierover eind januari een artikel in het tijdschrift Cell Reports. Mét daarin een relatief eenvoudige oplossing voor het belangrijkste probleem.

„Een van de moeilijkheden met crispr-cas9 is de negatieve invloed van een celmechanisme dat normaal gesproken juist nuttig is: dna-reparatie”, vertelt hoofdauteur Joost Schimmel. „Zodra er een breuk optreedt in het dna, zullen enzymen die breuk zo snel mogelijk herstellen. Dat doen ze ook zodra crispr-cas9 een breuk in het dna maakt. Alleen werkt dit dan de gewenste verandering van het dna tegen.”

Ziekmakende mutaties

Daardoor wordt ook de efficiëntie van crispr-cas9 een heel stuk lager. Meestal bevat maar zo’n 5 procent van de cellen na crispr-cas9 de gewenste verandering. Schimmel: „In de andere gevallen ontstaan door dit dna-herstel vaak willekeurige mutaties in het dna, namelijk als de eindjes op een foute manier aan elkaar worden gezet. Die mutaties kunnen problemen opleveren.”

Samen met Marcel Tijsterman, hoogleraar genoomstabiliteit aan de Universiteit Leiden, onderzoekt Schimmel hoe die dna-reparatie precies werkt en wat daarvan de gevolgen zijn. „Het dna-herstel gaat van nature niet altijd goed”, vertelt Tijsterman. „Daardoor ontstaan soms mutaties in het dna die kanker kunnen veroorzaken. Dat is een van de belangrijkste redenen dat we nog erg voorzichtig zijn rondom de toepassing van crispr-cas9 in de kliniek.”

Enzymen die dna-breuken in de cellen herstellen, zijn vaak zogeheten polymerases: enzymen die polymeren, dus lange moleculen, in elkaar kunnen zetten – in dit geval dna-moleculen, die bestaan uit lange ketens van nucleotiden. „Wij hebben ontdekt dat een van die polymerases, dna-polymerase theta, één specifieke manier van dna-herstel voor zijn rekening neemt. En dat is precies de manier die zoveel fouten veroorzaakt.”

De efficiëntie van de crispr-cas9 nam toe van 5 naar 50 procent

Marcel Tijsterman hoogleraar

Het gaat om zogeheten end joining, waarbij losse eindjes aan elkaar worden geknoopt waardoor stukjes dna verloren gaan. Dit in tegenstelling tot dna-herstel waarbij het enzym de breuk repareert op basis van een beschikbaar ‘voorbeeldstukje’ dna, dat je kunt toevoegen tijdens de crispr-cas9. „End joining is heel algemeen bij crispr-cas9”, legt Schimmel uit, „terwijl je in veel gevallen juist liever die andere vorm ziet. Daarmee kun je namelijk genen op een voorspelbare manier veranderen, en daarmee ziekmakende mutaties corrigeren.”

„Wij dachten: als we nu die end joining remmen, dan kan die andere vorm wellicht de overhand nemen”, vervolgt Tijsterman. „En dat is precies wat we zagen gebeuren. De efficiëntie van de crispr-cas9 nam toe van 5 naar 50 procent. Echt een aanzienlijke verbetering.”

Enzym blokkeren

De stof waarmee de Leidenaren het enzym blokkeren, is een klein molecuul dat erg lijkt op de nucleotiden – de bouwstenen – van het dna. Daardoor past het precies in de zogeheten actieve site van het enzym: de plek waarmee het aan het losse dna-uiteinde hecht en er nieuwe nucleotiden aan vast koppelt, als de zipper van een ritssluiting. Zo remt het molecuul de werking van het enzym.

„Deze remmer is een stof die in de kankerbiologie al wordt gebruikt om dna-polymerase theta te remmen”, vertelt Tijsterman. „Bij bepaalde erfelijke borstkankers, bijvoorbeeld die samenhangen met zogeheten BRCA-genen, ligt het probleem precies bij diezelfde manier van dna-herstel. Door end joining krijg je foutieve reparaties waardoor kankercellen kunnen ontstaan. Ook hier doen mensen onderzoek naar het remmen van dna-polymerase theta om die end joining te stoppen.”

Fluoresceren

Lag het dan niet erg voor de hand dat dit molecuul en deze aanpak ook zouden kunnen helpen om crispr-cas9 te verbeteren? „Soms ben je zo gefocust op het één dat je het ander niet ziet”, antwoordt Tijsterman. „Ik zit zelf meer in de kankerbiologie dan in toepassingen van crispr-cas9, vandaar. En je weet van tevoren ook nooit wat er in een cel gaat gebeuren als je bepaalde mechanismen remt. Neemt dan een ander mechanisme de overhand, of gaat de cel gewoon dood? Dat blijkt dus goed uit te pakken bij crispr-cas9.”

Hoe onderzoek je dat eigenlijk? „Op gen-niveau kunnen we achteraf met sequencing aantonen wat er is veranderd”, antwoordt Schimmel. „Dus door de dna-volgorde in kaart te brengen. Zo kun je voor miljoenen cellen tegelijkertijd aantonen wat de frequentie is van een bepaalde mutatie.”

Maar om live te kunnen volgen wat er gebeurt, gebruiken de onderzoekers ook specifieke cellen in het laboratorium. Schimmel: „Bijvoorbeeld cellen die een groen fluorescerend eiwit produceren. Via crispr-cas9 kunnen we het dna van die cellen heel gemakkelijk zodanig wijzigen dat ze blauw gaan fluoresceren, in plaats van groen. Zonder end-joiningremmers zien we bijvoorbeeld 5 procent blauw fluoresceren. Mét remmers wordt dat dan opeens 50 tot 70 procent.”

Er is nog veel wat we eerst echt goed moeten uitzoeken

Joost Schimmel onderzoeker

Tijsterman: „Dat is wel fantastisch, dat je dat gewoon onder de microscoop kunt zien.” Collega’s vielen zowat van hun stoel toen ze de resultaten zagen, aldus de hoogleraar. „Sommigen worstelen al jarenlang met lage succespercentages. Ik verwacht echt dat iedereen die werkt met crispr-cAS9 nu deze remmers gaat toevoegen.”

Dat wil overigens niet meteen zeggen dat deze aanpak snel de kliniek zal gaan veroveren, benadrukken beide onderzoekers. „Er is nog veel wat we eerst echt goed moeten uitzoeken”, zegt Schimmel. „Bijvoorbeeld: waaróm neemt het aandeel van dat andere reparatiemechanisme toe? Is dat omdat er op andere vlakken meer cellen doodgaan? Of omdat de cel efficiënter gebruik maakt van de dna-mal die je toevoegt? En zijn er wellicht nadelige gevolgen van het gebruik van deze remmers? Die basis moeten we echt eerst beter begrijpen.”

„Dit stofje is niet meteen de wonderpil”, zegt ook Tijsterman, „maar het maakt deze techniek wel meteen veel mooier en beter.”